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星空app:巴瑞克替尼磷酸盐的生物活性和实验方法

发布时间:2018-10-20 20:45:59 编辑作者:活性小子

巴瑞克替尼磷酸盐图片

图片:巴瑞克替尼磷酸盐结构式

巴瑞克替尼磷酸盐是一种选择性的,可口服的 JAK1/JAK2 抑制剂,IC50 值分别为 5.9 nM 和 5.7 nM。

一、巴瑞克替尼磷酸盐的生物活性:
1)体外活性
在基于细胞的测定中,巴瑞克替尼(INCB028050)被证明是JAK信号传导和功能的有效抑制剂。 在PBMC中,巴瑞克替尼抑制IL-6刺激的经典底物STAT3(pSTAT3)的磷酸化和随后的趋化因子MCP-1的产生,IC50值分别为44nM和40nM。 在分离的幼稚T细胞中,INCB028050还抑制IL-23刺激的pSTAT3(IC50 = 20nM)。 重要的是,这种抑制作用阻止了Th17细胞产生的两种致病细胞因子(IL-17和IL-22) - 一种具有明显炎症和致病特性的辅助性T细胞亚型 - IC50值为50nM。 与之形成鲜明对比的是,结构相似但无效的JAK1 / 2抑制剂INCB027753和INCB029843在浓度高达10μM的情况下测试时,在任何这些检测系统中均无显着影响[1]。

2)体内活性
与载体相比,巴瑞克替尼(INCB028050)治疗在2周治疗期间以1mg / kg的剂量抑制50%的后爪体积增加,并且在3或10mg / kg的剂量下抑制> 95%。 因为基线爪体积测量是在具有显着疾病迹象的动物的治疗第0天进行的,所以在肿胀中可以有> 100%的抑制作用,显示肿胀明显改善[1]。 当与载体对照处理的小鼠相比时,通过H&E染色评估的巴瑞克替尼(0.7mg /天)处理的小鼠表现出显着减少的炎症,降低的CD8浸润和降低的MHC I类和II类表达。 与载体对照处理的小鼠相比,巴瑞克替尼处理的小鼠中CD8 + NKG2D +细胞是鼠和人秃头症(AA)中疾病的关键效应物,其大大减少[2]。

二、巴瑞克替尼磷酸盐的生物活性实验方法:
1)细胞实验
通过白细胞分离术分离人PBMC,然后进行Ficoll-Hypaque离心。 为了测定IL-6诱导的MCP-1产生,在存在或不存在各种浓度的INCB028050(1 nM,10 nM,100 nM)的情况下,将PBMC以每孔3.3×10 5个细胞接种于RPMI 1640 + 10%FCS中。 ,1μM和10μM)。 在室温下与星空app预孵育10分钟后,通过向每个孔中加入10ng / mL人重组IL-6来刺激细胞。 将细胞在37℃,5%CO 2下孵育48小时。 收获上清液并通过ELISA分析人MCP-1的水平。 INCB028050抑制IL-6诱导的MCP-1分泌的能力被报道为50%抑制所需的浓度(IC50)。 使用Cell-Titer Glo [1]在3天内进行Ba / F3-TEL-JAK3细胞的增殖。

2)动物实验
大鼠[1]
雌性大鼠(每组性别n = 6)给予10mg / kg 巴瑞克替尼剂量,并以10mL / kg口服强饲法给予。前3只大鼠在0(给药前),2小时,8小时和24小时放血,并且在给药后1,4和12小时对第二只三只大鼠放血。 EDTA用作抗凝血剂,并将样品离心以获得血浆。已经开发了用于定量INCB028050的分析方法并用于分析来自毒理学研究的样品。该方法将蛋白质沉淀萃取与10%甲醇在乙星空app中进行结合并进行LC / MS / MS分析。该方法使用0.1mL研究样品证明线性测定范围为1-5000nM。使用Analyst 1.3.1处理数据。使用加权线性回归(1 / x2)从峰面积比对浓度确定标准曲线。
小鼠[2]
AA的C3H / HeJ移植受体小鼠模型用于这些实验。简言之,将来自自发性脱发的C3H / HeJ小鼠的脱发性皮肤移植到没有疾病的8-10周龄C3H / HeJ小鼠上。在移植时,植入施用约0.7mg /天的巴瑞克替尼或安慰剂的渗透泵。渗透泵每月更换一次。进行间隔删失数据的时间 - 事件生存分析。 R中的生存和间隔包用于执行对数秩检验。在(n = 10)巴瑞克替尼治疗的小鼠和(n = 10)安慰剂治疗的小鼠中,存活分布相等的假设在5%的水平被拒绝,使用Sun的评分进行精确的对数秩双样本检验p值为0.0035。

3)激酶实验
使用具有重组表位标记的激酶结构域的均相时间分辨荧光测定法(JAK1,837-1142; JAK2,828-1132; JAK3,718-1124; Tyk2,873-1187)或全长酶(cMET)进行酶测定。 和Chk2)和肽底物。 每种酶反应在有或没有测试星空app(11点稀释),JAK,cMET或Chk2酶,500nM(Chk2为100nM)肽,ATP(对每种激酶特异性的Km或1mM)下进行,和 在测定缓冲液中加入2.0%DMSO。 计算的IC 50值是抑制50%荧光信号所需的星空app浓度。 使用200nM的标准条件在Cerep进行另外的激酶测定。 测试的酶包括:Abl,Akt1,AurA,AurB,CDC2,CDK2,CDK4,CHK2,c-kit,EGFR,EphB4,ERK1,ERK2,FLT-1,HER2,IGF1R,IKKα,IKKβ,JNK1,Lck,MEK1, p38α,p70S6K,PKA,PKCα,Src和ZAP70 [1]。

综上所述:巴瑞克替尼磷酸盐是一种选择性的,可口服的 JAK1/JAK2 抑制剂。它的靶点活性为JAK1,5.9nM;JAK2,5.7nM;JAK3,>400nM;Tyk2,53nM。

参考文献:
[1]. Fridman JS, et al. Selective inhibition of JAK1 and JAK2 is efficacious in rodent models of arthritis: preclinical characterization of INCB028050. J Immunol. 2010 May 1;184(9):5298-307.
[2]. Jabbari A, et al. Reversal of Alopecia Areata Following Treatment With the JAK1/2 Inhibitor Baricitinib. EBioMedicine. 2015 Feb 26;2(4):351-5.

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